Molekylärbiologisk metodik

Dag 1

·         Rening av rekombinant plasmid

·         Koncentration och renhetsbestämning av plasmidpreparation.

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Vad jag vill ha kvar efter reningen är själva plasmiden innehållande den insatta genen LL-37 och därför vill jag rena bort de kvarvarande beståndsdelarna från bakterierna. Bakterierna utsattes för en pH-förändring vilket resulterade i att kromosomen, proteinerna och cellmembranet denaturerade. När sedan en neutralisering av lysatet sker i samband med centrifugering bör dessa ändra sin tredimensionella struktur och packas ned i den bildade pelleten och därför kunna avlägsnas från provet. Men det är inte säkert att allt protein hamnar i pelleten och därmed kan avlägsnas, särskilt de små proteinerna kan vara svåra att få bort. Genom tillsats av PB och sedan av PE vilka båda innehåller lite chaotropiskt salt, borde de proteiner som lämnats kvar efter den alkaliska denatureringen och RNA: t kunna tvättas bort. Om jag har förstått det hela rätt är det chaotropiska saltet en nödvändighet för att få RNA: t och DNA: t att binda till silicagelen i QIAprep spin columnen via katjonbroar. När gelen sedan centrifugeras lämnar RNA: t den med vätskan i uppsamlingsröret. Det beror på att RNA: t bara kan bilda bindningar till gelen med hälften så många bindningar som DNA: t kan p.g.a att den är enkelsträngad.

Det chaotropiska saltets funktion är visst att skapa en hydrofob miljö runt DNA/RNA-molekylerna vilket gör att silicagelen är den mest passande bindningspartnern för DNA/RNA: t. Eventuella protein och metaboliter som finns kvar i röret binder inte och kan därför tvättas bort. Katjonerna i saltet ger gelen ett positivt ytskikt som ytterligare gynnar DNA-molekylernas bindning till det. Efter rening av gelen borde den bara innehålla plasmiderna från bakterierna - en liten mängd av t.ex. protein kan dröja sig kvar i provet men det mesta borde ha följt med ut vid tvätten.

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Genom att göra en spektrofotometrisk undersökning av vår framtagna plasmid-lösning kom vi fram till att den framtagna plasmidlösningen var tillräckligt ren från protein för att kunna användas. Absorbansvärdet för 260nm dividerades med absorbansvärdet för 280nm och kvoten jämfördes med en mall. Värdet borde ligga mellan 1,6-2,0A för att vara godtagbart och det beräknade värdet blev 1,84.

Den framtagna kurvan för skanning av plasmidprov mellan 230-300nm.

Ett prov som innehåller rent DNA har hög absorbans vid 260nm och kvot på ungefär 1,8. Ett prov som däremot innehåller en hög andel protein har hög absorbans vid 280nm och en låg kvot på runt 1,3. Det borde innebära att det framtagna värdet på 1,84 innehåller en hel del DNA, men det är inte säkert. Protein är inte ensamt om att ha hög absorption vid 280nm och samma sak gäller för DNA: s absorption. Det enda vi egentligen vet är att vi har absorbans vid 280 och 260nm men vad det faktiskt beror på är inte helt säkert. Förhoppningsvis har inte reningen gått så fel att en alltför stor del av absorptionen upptas av oidentifierade föroreningar, men det är inte säkert.

Den beräknade koncentrationen för plasmid DNA-provet var 0,35µg/µL innan spädningen inför spektrofotometrin.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Jag skulle mer i detalj vilja veta vad de olika buffertarna och momenten under laborationen gör med provet på molekylärnivå. Jag tycker att det blir lättare att komma ihåg funktionen av de olika momenten om jag i detalj vet varför de används.