Dag 2

• PCR-reaktion för kontroll av insert

• Kontrollelektrofores på plasmidpreparation respektive PCR-reaktion

• Klyvning av plasmid-DNA med EcoR1

1. Idag har du utfört en PCR. Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Resultatet efter dagen PCR-laboration är godkänt. Syftet med laborationen var att via PCR ta reda på om LL-37-genen fanns i den plasmid som från början framrenats från E. coli bakterierna. För att med säkerhet kunna avgöra vilket insertet var i den tidigare från E. coli bakterier framrenade plasmiden måste mängden av insertet först förstärkas med hjälp av PCR.

Inför PCR-reaktionen förbereddes tre rör med olika innehåll. Ett rör (Rör 1) innehöll matermix med innehåll nödvändigt för att polymeraset skulle fungera optimalt och en spädd lösning med den plasmid som skulle undersökas. Rör 2 innehöll samma mastermix, men med vatten stället för plasmid. Meningen var att rör nummer 2 skulle fungera som en negativ kontroll för PCR-rektionen när den överfördes på gel. Det borde inte ha funnits något DNA i det andra röret och därför borde brunnen på gelen vilken innehöll ”rör 2” inte ha gett något utslag när gelen sedan undersöktes med UV-ljus. Inget i den borde ha kunnat binda den DNA-bindande färgen och därför borde den linjen vara svart. Om undersökningen med UV-ljus ändå visade ett band tyder det på att kontamination föreligger. Rör 3 innehöll mastermix och känd LL-37-gen. Den skulle fungera som en positiv kontroll. När gelen undersöktes med UV-ljus borde linjen för rör 3 innehålla ett band med stark färg vilket skulle markera LL-37-genens vandringssträcka från brunnarna. Om inget band kunde hittas kan det tyda på att Taq DNA-polymeraset var defekt eller att PCR-rektionen av annan anledning inte fungerat.

PCR-provernas innehåll och kvalité testades på gelelektrofores med en agarosgel. Förutom PCR-proverna ”Rör 1-3” sattes ett prov med den från tidigare laborationsdag framrenade plasmiden (se ”Dag 1”). Syftet med det var att kontrollera kvalitén på plasmiden i provet och avgöra om provet innehöll någon form av kontaminering i form av RNA eller kromosomalt DNA. Två prover med DNA-marker, III och IX, sattes också till gelen för att fungera som mallar när storleken på de andra provernas innehåll bedömdes (se figur 1).

Figur 1. Agarosgelen nedsänkt i buffert precis innan elektroforesen inleds. De blå banden till vänster i bilden  är brunnarna fyllda med färgat innehåll. 

Ordningen med vilken proverna sattes till gelens brunnar, räknat från vänster till höger var: Rör 2, Plasmidprov, DNA III, Rör 1, DNA IX, Rör 3. (Se figur 2)

Figur 2. Agarosgelen efter avslutad gelelektrofores under belysning med UV-ljus

2. Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Den negativa kontrollen (Rör 2) visar en tydlig ”smear” vilket tyder på kontamination i form av främmande DNA i provet. Det visar att laboranterna på något sätt har fått in främmande DNA i provet innan det sattes till PCR. Det skulle om syftet med den här PCR-reaktionen varit ett annat ha kunnat göra resultatet osäkert men vid denna PCR-undersökning gör det inte det. Det beror på att syftet med reaktionen var att få reda på om insertet i plasmiden verkligen var LL-37. Genom att jämföra band nr. fyra vilket innehöll den undersökta plasmiden med band nr. sex vilket var LL-37-genen går det tydligt att se att bandet ligger på samma höjd. Om längden med vilket bandet vandrat för det okända insertet jämförs med DNA-marker IX går det att se att längden stämmer överens med den förväntade längden för LL-37-genen; runt 600 baspar.

Band nummer två (räknat från vänster till höger) vilken visar vandringen genom gelen för plasmiden med det okända insertet innehåller två band. Det innebär att plamid-röret innehållit två olika produkter i tillräckligt stor mängd för att de ska ha gett upphov till två band. Genom att jämföra linjerna för band nummer två med linjerna från band nummer tre (DNA-markör III) går det att utläsa att den övre linjen längs band nummer två visar plasmiden i cirkulär form och den undre linjen visar plasmiden i mer kompakt form. Under behandlingen som ledde fram till att provet placerades på gelen har röret vilket innehöll plasmiden utsatts för mekanisk stress vilket har fått plasmiden har släppt från sin mer kompakta form. Den utvecklade plasmiden vandrar långsammare ned inom gelen för att den tar mer plats och därför bromsas mer av gelen än den veckade plasmiden. Resultatet blir två klara linjer. Den undre linjen är starkare vilket innebär att den större delen av plasmiden fortfarande befinner sig i sin veckade form. Att det endast finns två för ögat synliga linjer på bandet visar att inga betydande mängder RNA eller kromosomalt DNA finns kvar i provet efter reningen av bakterielysatet (se ”Dag 1”). Det betyder att reningen av plasmiden lyckades.