Dag 3+4

• Elektrofores av klyvt material och Southern blot

• Inmärkning av LL-37 gen med DIG-dUTP(random priming)

• Fixering av DNA till membran med UV-bestrålning

• Prehybridisering

• Hybridisering Ö.N

• Stringenstvätt

• Detektion

1. Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Under PCR-reaktionen förstärktes mängden insert för att det skulle bli avläsligt på en agarosgel via gelelektrofores. Gelelektrofores är en metod som här används för att ifall något insert över huvudtaget har förstärkts under PCR-reaktionen, hur långt insertet, om någon RNA- eller insert-kontamination föreligger och kvalitén på den framtagna plasmiden.

För att bestämma om något insert har förstärkts genom PCR-reaktionen undersöks gelen efter linjer längs banden. En tydlig linje innebär att en produkt har förstärks i stor mängd och en svag linje betyder att endast en liten mängd av produkten har förstärkts. Om inget band visas alls har inte PCR-reaktionen fungerat vilket gör att inga slutsatser om den förstärkta plasmiden kan dras.

Avståndet räknat från brunnen dit det förstärkta insertet sattes till platsen den vandrar under gelelektroforesen jämförs med en storleksmall för att avgöra längden på insertet. Det kan ge en indikation på ifall det erhållna förstärkta insertet är det sökta eller ett resultat ifrån en kontamination. En RNA-kontaminering visas i form av att en blurr längst ned på bandet framträder. Det beror på att eventuella rester av RNA är småbitar som under tidigare förberedelse av plasmiden deltas av RNase.  

Om kontaminationen beror på förorening i provet, antingen utifrån av ett främmande DNA eller av det förväntade insertet från en annan källa än från origonal-patientprovet, kontrolleras bäst med hjälp av en negativ kontroll. Den negativa kontrollen innehåller (som tidigare beskrivits) inget insert och bör där med lämna ett helt svart band efter sig. Om ett band ändå visas och samma band finns representerat på bandet som tillhör det via PCR-förstärkta insertet går ingen slutsats om insertet i det undersökta provet att dra. Insertet i provet kan i sådana fall vara ett resultat av kontamination så som i den negativa kontrollen och försöket måste börjas om från början. Syftet med den positiva kontrollen (som tidigare beskrivits) är att se om PCR-reaktionen alls har fungerat.

Det går att avgöra genom utseendet på banden på gelen om plasmiden är i ”super coil-form”, cirkulär fom eller i linjär form p.g.a. mekanisk stress. Om plasmiden skulle ha veckat sig tätare än super coil går också att se. Med metoden går det dock inte att se ifall någon proteinkontamination föreligger för att proteinet inte binder färgämnet.

För att se om det finns någon proteinkontaminering används en spektrofotometrisk analys av absorbansen i det PCR-förstärkta provet. Genom att mäta absorbansen vid 280nm där proteiner har sin maximala absorbans, vid 260nm där DNA har sin maximala absorbans och sedan jämföra kvoten mellan värdena mot ett kontrollvärde går det att avgöra om provet är kontaminerat. Att provet har hög absorbans vid 280nm behöver inte nödvändigtvis betyda att provet är kontaminerat av protein, men vid den här typen av undersökning är proteinkontamination den vanligaste anledningen. Koncentrationen av DNA i provet bestäms genom att multiplicera absorbansvärdet för 260nm med 50µg/mL (koncentrationen för en absorbans på 1A).

Inom Southern blot klyvs insertet ut ur vektorn med restriktionsenzymet EcoR1. När insertet blivit lijärt går det att jämföra mot en linjär storleksmall på en agarosgel från en gelelektrofores. Gelen behandlas med NaOH för att denaturera DNA: t och medd SSC för att de negativt laddade DNA-molekylerna ska dras mot och fastna på membranet. Membranet utsätts för en prehybridisering för att inte främmande DNA ska kunna binda till det och orsaka felaktiga positiva svar. Ytterligare en prehybridisring genomförs efter behandling av mambranet för att proben inte ska kunna hybridisera till det fria membranet. Ospecifika hybridiseringar tvättas därefter bort. Antikroppar med inmärkning tillsätts och binder till proberna. Detektion sker genom att ett substrat tillsätts och klyvs av ett till antikropparna kopplat enzym. Resultatet blir en färgförändring.

Med Southern blot går det att detektera specifikt DNA; DNA som är kompatibelt med de prober som tillsätts. En nackdel är att främmande DNA som inte proberna är designade för inte kan detekteras med metoden. Om proberna inte binder specifikt kommer de att tvättas bort under stringenstvätten. I sådana fall blir det inga band när membranet genomgått behandling med antikroppar. Inom PCR behöver inte det detekterade materialet vara just det som laboranten söker efter för att det ska synas på gelen. För att kunna detektera någon främmande typ av kontamination är därför PCR en bättre metod att välja. Det gör metoden bredare men samtidigt blir storleksmarkörer nödvändiga för att försäkra laboranten om att det detekterade insertet verkligen var det insertet som eftersöktes. Någon proteinkontamination går inte heller att besluta om efter en Southern blot analys.

Suthern blot är känslig, något som visade sig när resultatet för de båda metoderna jämfördes med varandra; den kluvna plasmid som sattes till brunnen med mängden 0,005µg plasmid syntes inte på fotot som togs på gelelektroforesen över provet(dag 3). Samma gel användes för membranet till Southern blot och där var linjen mycket tydlig efter behandling med antikroppar(se figur 1.). Om plasmiden antagit andra strukturer än super coil p.g.a. mekanisk stress är det lättare att detektera med Southern blot i och med dess känslighet för den eftersökta DNA-sekvensen.

Figur 1. Southern blot-membranet. Fr. V-H: oklippt plasmid, DNAIII, klippt  plasmid 0,5 mikrogram, DNAIX, klippt plasmid 0,005 mikrogram.

Inom PCR används inga material som är direkt hälsofarliga. GelRed kräver användning av handskar, men den färgningsmetoden förekommer för geler inom båda metoderna. Inom Southern blot används dock NBT/BCIP vilket är ett carcinogent ämne vilket bör behandlas med försiktighet. Ur kostnadssynpunkt bör dessutom Southern blot vara sämre. Båda metoderna utgår från en förstärkning av den eftersökta genen följt av en elektrofores. Inom Southern blot går metoden ännu längre när gelens material sedan ska överföras till ett speciellt membran som sedan så småningom behöver antikroppar för detektion.  

2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Hur en Southern blot analys fungerar både teoretiskt och praktiskt. Vilka komponenter den utgår ifrån, hur resultatet blir och hur det sedan tolkas. 

Dag 2

• PCR-reaktion för kontroll av insert

• Kontrollelektrofores på plasmidpreparation respektive PCR-reaktion

• Klyvning av plasmid-DNA med EcoR1

1. Idag har du utfört en PCR. Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Resultatet efter dagen PCR-laboration är godkänt. Syftet med laborationen var att via PCR ta reda på om LL-37-genen fanns i den plasmid som från början framrenats från E. coli bakterierna. För att med säkerhet kunna avgöra vilket insertet var i den tidigare från E. coli bakterier framrenade plasmiden måste mängden av insertet först förstärkas med hjälp av PCR.

Inför PCR-reaktionen förbereddes tre rör med olika innehåll. Ett rör (Rör 1) innehöll matermix med innehåll nödvändigt för att polymeraset skulle fungera optimalt och en spädd lösning med den plasmid som skulle undersökas. Rör 2 innehöll samma mastermix, men med vatten stället för plasmid. Meningen var att rör nummer 2 skulle fungera som en negativ kontroll för PCR-rektionen när den överfördes på gel. Det borde inte ha funnits något DNA i det andra röret och därför borde brunnen på gelen vilken innehöll ”rör 2” inte ha gett något utslag när gelen sedan undersöktes med UV-ljus. Inget i den borde ha kunnat binda den DNA-bindande färgen och därför borde den linjen vara svart. Om undersökningen med UV-ljus ändå visade ett band tyder det på att kontamination föreligger. Rör 3 innehöll mastermix och känd LL-37-gen. Den skulle fungera som en positiv kontroll. När gelen undersöktes med UV-ljus borde linjen för rör 3 innehålla ett band med stark färg vilket skulle markera LL-37-genens vandringssträcka från brunnarna. Om inget band kunde hittas kan det tyda på att Taq DNA-polymeraset var defekt eller att PCR-rektionen av annan anledning inte fungerat.

PCR-provernas innehåll och kvalité testades på gelelektrofores med en agarosgel. Förutom PCR-proverna ”Rör 1-3” sattes ett prov med den från tidigare laborationsdag framrenade plasmiden (se ”Dag 1”). Syftet med det var att kontrollera kvalitén på plasmiden i provet och avgöra om provet innehöll någon form av kontaminering i form av RNA eller kromosomalt DNA. Två prover med DNA-marker, III och IX, sattes också till gelen för att fungera som mallar när storleken på de andra provernas innehåll bedömdes (se figur 1).

Figur 1. Agarosgelen nedsänkt i buffert precis innan elektroforesen inleds. De blå banden till vänster i bilden  är brunnarna fyllda med färgat innehåll. 

Ordningen med vilken proverna sattes till gelens brunnar, räknat från vänster till höger var: Rör 2, Plasmidprov, DNA III, Rör 1, DNA IX, Rör 3. (Se figur 2)

Figur 2. Agarosgelen efter avslutad gelelektrofores under belysning med UV-ljus

2. Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Den negativa kontrollen (Rör 2) visar en tydlig ”smear” vilket tyder på kontamination i form av främmande DNA i provet. Det visar att laboranterna på något sätt har fått in främmande DNA i provet innan det sattes till PCR. Det skulle om syftet med den här PCR-reaktionen varit ett annat ha kunnat göra resultatet osäkert men vid denna PCR-undersökning gör det inte det. Det beror på att syftet med reaktionen var att få reda på om insertet i plasmiden verkligen var LL-37. Genom att jämföra band nr. fyra vilket innehöll den undersökta plasmiden med band nr. sex vilket var LL-37-genen går det tydligt att se att bandet ligger på samma höjd. Om längden med vilket bandet vandrat för det okända insertet jämförs med DNA-marker IX går det att se att längden stämmer överens med den förväntade längden för LL-37-genen; runt 600 baspar.

Band nummer två (räknat från vänster till höger) vilken visar vandringen genom gelen för plasmiden med det okända insertet innehåller två band. Det innebär att plamid-röret innehållit två olika produkter i tillräckligt stor mängd för att de ska ha gett upphov till två band. Genom att jämföra linjerna för band nummer två med linjerna från band nummer tre (DNA-markör III) går det att utläsa att den övre linjen längs band nummer två visar plasmiden i cirkulär form och den undre linjen visar plasmiden i mer kompakt form. Under behandlingen som ledde fram till att provet placerades på gelen har röret vilket innehöll plasmiden utsatts för mekanisk stress vilket har fått plasmiden har släppt från sin mer kompakta form. Den utvecklade plasmiden vandrar långsammare ned inom gelen för att den tar mer plats och därför bromsas mer av gelen än den veckade plasmiden. Resultatet blir två klara linjer. Den undre linjen är starkare vilket innebär att den större delen av plasmiden fortfarande befinner sig i sin veckade form. Att det endast finns två för ögat synliga linjer på bandet visar att inga betydande mängder RNA eller kromosomalt DNA finns kvar i provet efter reningen av bakterielysatet (se ”Dag 1”). Det betyder att reningen av plasmiden lyckades. 

Molekylärbiologisk metodik

Dag 1

·         Rening av rekombinant plasmid

·         Koncentration och renhetsbestämning av plasmidpreparation.

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Vad jag vill ha kvar efter reningen är själva plasmiden innehållande den insatta genen LL-37 och därför vill jag rena bort de kvarvarande beståndsdelarna från bakterierna. Bakterierna utsattes för en pH-förändring vilket resulterade i att kromosomen, proteinerna och cellmembranet denaturerade. När sedan en neutralisering av lysatet sker i samband med centrifugering bör dessa ändra sin tredimensionella struktur och packas ned i den bildade pelleten och därför kunna avlägsnas från provet. Men det är inte säkert att allt protein hamnar i pelleten och därmed kan avlägsnas, särskilt de små proteinerna kan vara svåra att få bort. Genom tillsats av PB och sedan av PE vilka båda innehåller lite chaotropiskt salt, borde de proteiner som lämnats kvar efter den alkaliska denatureringen och RNA: t kunna tvättas bort. Om jag har förstått det hela rätt är det chaotropiska saltet en nödvändighet för att få RNA: t och DNA: t att binda till silicagelen i QIAprep spin columnen via katjonbroar. När gelen sedan centrifugeras lämnar RNA: t den med vätskan i uppsamlingsröret. Det beror på att RNA: t bara kan bilda bindningar till gelen med hälften så många bindningar som DNA: t kan p.g.a att den är enkelsträngad.

Det chaotropiska saltets funktion är visst att skapa en hydrofob miljö runt DNA/RNA-molekylerna vilket gör att silicagelen är den mest passande bindningspartnern för DNA/RNA: t. Eventuella protein och metaboliter som finns kvar i röret binder inte och kan därför tvättas bort. Katjonerna i saltet ger gelen ett positivt ytskikt som ytterligare gynnar DNA-molekylernas bindning till det. Efter rening av gelen borde den bara innehålla plasmiderna från bakterierna - en liten mängd av t.ex. protein kan dröja sig kvar i provet men det mesta borde ha följt med ut vid tvätten.

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid?

Genom att göra en spektrofotometrisk undersökning av vår framtagna plasmid-lösning kom vi fram till att den framtagna plasmidlösningen var tillräckligt ren från protein för att kunna användas. Absorbansvärdet för 260nm dividerades med absorbansvärdet för 280nm och kvoten jämfördes med en mall. Värdet borde ligga mellan 1,6-2,0A för att vara godtagbart och det beräknade värdet blev 1,84.

Den framtagna kurvan för skanning av plasmidprov mellan 230-300nm.

Ett prov som innehåller rent DNA har hög absorbans vid 260nm och kvot på ungefär 1,8. Ett prov som däremot innehåller en hög andel protein har hög absorbans vid 280nm och en låg kvot på runt 1,3. Det borde innebära att det framtagna värdet på 1,84 innehåller en hel del DNA, men det är inte säkert. Protein är inte ensamt om att ha hög absorption vid 280nm och samma sak gäller för DNA: s absorption. Det enda vi egentligen vet är att vi har absorbans vid 280 och 260nm men vad det faktiskt beror på är inte helt säkert. Förhoppningsvis har inte reningen gått så fel att en alltför stor del av absorptionen upptas av oidentifierade föroreningar, men det är inte säkert.

Den beräknade koncentrationen för plasmid DNA-provet var 0,35µg/µL innan spädningen inför spektrofotometrin.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Jag skulle mer i detalj vilja veta vad de olika buffertarna och momenten under laborationen gör med provet på molekylärnivå. Jag tycker att det blir lättare att komma ihåg funktionen av de olika momenten om jag i detalj vet varför de används. 

Bloggen uppstartad

Här kommer min blogg om molekylärbiologi och molekylärbiologisk metodik laborationerna!