Dag 3+4

• Elektrofores av klyvt material och Southern blot

• Inmärkning av LL-37 gen med DIG-dUTP(random priming)

• Fixering av DNA till membran med UV-bestrålning

• Prehybridisering

• Hybridisering Ö.N

• Stringenstvätt

• Detektion

1. Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Under PCR-reaktionen förstärktes mängden insert för att det skulle bli avläsligt på en agarosgel via gelelektrofores. Gelelektrofores är en metod som här används för att ifall något insert över huvudtaget har förstärkts under PCR-reaktionen, hur långt insertet, om någon RNA- eller insert-kontamination föreligger och kvalitén på den framtagna plasmiden.

För att bestämma om något insert har förstärkts genom PCR-reaktionen undersöks gelen efter linjer längs banden. En tydlig linje innebär att en produkt har förstärks i stor mängd och en svag linje betyder att endast en liten mängd av produkten har förstärkts. Om inget band visas alls har inte PCR-reaktionen fungerat vilket gör att inga slutsatser om den förstärkta plasmiden kan dras.

Avståndet räknat från brunnen dit det förstärkta insertet sattes till platsen den vandrar under gelelektroforesen jämförs med en storleksmall för att avgöra längden på insertet. Det kan ge en indikation på ifall det erhållna förstärkta insertet är det sökta eller ett resultat ifrån en kontamination. En RNA-kontaminering visas i form av att en blurr längst ned på bandet framträder. Det beror på att eventuella rester av RNA är småbitar som under tidigare förberedelse av plasmiden deltas av RNase.  

Om kontaminationen beror på förorening i provet, antingen utifrån av ett främmande DNA eller av det förväntade insertet från en annan källa än från origonal-patientprovet, kontrolleras bäst med hjälp av en negativ kontroll. Den negativa kontrollen innehåller (som tidigare beskrivits) inget insert och bör där med lämna ett helt svart band efter sig. Om ett band ändå visas och samma band finns representerat på bandet som tillhör det via PCR-förstärkta insertet går ingen slutsats om insertet i det undersökta provet att dra. Insertet i provet kan i sådana fall vara ett resultat av kontamination så som i den negativa kontrollen och försöket måste börjas om från början. Syftet med den positiva kontrollen (som tidigare beskrivits) är att se om PCR-reaktionen alls har fungerat.

Det går att avgöra genom utseendet på banden på gelen om plasmiden är i ”super coil-form”, cirkulär fom eller i linjär form p.g.a. mekanisk stress. Om plasmiden skulle ha veckat sig tätare än super coil går också att se. Med metoden går det dock inte att se ifall någon proteinkontamination föreligger för att proteinet inte binder färgämnet.

För att se om det finns någon proteinkontaminering används en spektrofotometrisk analys av absorbansen i det PCR-förstärkta provet. Genom att mäta absorbansen vid 280nm där proteiner har sin maximala absorbans, vid 260nm där DNA har sin maximala absorbans och sedan jämföra kvoten mellan värdena mot ett kontrollvärde går det att avgöra om provet är kontaminerat. Att provet har hög absorbans vid 280nm behöver inte nödvändigtvis betyda att provet är kontaminerat av protein, men vid den här typen av undersökning är proteinkontamination den vanligaste anledningen. Koncentrationen av DNA i provet bestäms genom att multiplicera absorbansvärdet för 260nm med 50µg/mL (koncentrationen för en absorbans på 1A).

Inom Southern blot klyvs insertet ut ur vektorn med restriktionsenzymet EcoR1. När insertet blivit lijärt går det att jämföra mot en linjär storleksmall på en agarosgel från en gelelektrofores. Gelen behandlas med NaOH för att denaturera DNA: t och medd SSC för att de negativt laddade DNA-molekylerna ska dras mot och fastna på membranet. Membranet utsätts för en prehybridisering för att inte främmande DNA ska kunna binda till det och orsaka felaktiga positiva svar. Ytterligare en prehybridisring genomförs efter behandling av mambranet för att proben inte ska kunna hybridisera till det fria membranet. Ospecifika hybridiseringar tvättas därefter bort. Antikroppar med inmärkning tillsätts och binder till proberna. Detektion sker genom att ett substrat tillsätts och klyvs av ett till antikropparna kopplat enzym. Resultatet blir en färgförändring.

Med Southern blot går det att detektera specifikt DNA; DNA som är kompatibelt med de prober som tillsätts. En nackdel är att främmande DNA som inte proberna är designade för inte kan detekteras med metoden. Om proberna inte binder specifikt kommer de att tvättas bort under stringenstvätten. I sådana fall blir det inga band när membranet genomgått behandling med antikroppar. Inom PCR behöver inte det detekterade materialet vara just det som laboranten söker efter för att det ska synas på gelen. För att kunna detektera någon främmande typ av kontamination är därför PCR en bättre metod att välja. Det gör metoden bredare men samtidigt blir storleksmarkörer nödvändiga för att försäkra laboranten om att det detekterade insertet verkligen var det insertet som eftersöktes. Någon proteinkontamination går inte heller att besluta om efter en Southern blot analys.

Suthern blot är känslig, något som visade sig när resultatet för de båda metoderna jämfördes med varandra; den kluvna plasmid som sattes till brunnen med mängden 0,005µg plasmid syntes inte på fotot som togs på gelelektroforesen över provet(dag 3). Samma gel användes för membranet till Southern blot och där var linjen mycket tydlig efter behandling med antikroppar(se figur 1.). Om plasmiden antagit andra strukturer än super coil p.g.a. mekanisk stress är det lättare att detektera med Southern blot i och med dess känslighet för den eftersökta DNA-sekvensen.

Figur 1. Southern blot-membranet. Fr. V-H: oklippt plasmid, DNAIII, klippt  plasmid 0,5 mikrogram, DNAIX, klippt plasmid 0,005 mikrogram.

Inom PCR används inga material som är direkt hälsofarliga. GelRed kräver användning av handskar, men den färgningsmetoden förekommer för geler inom båda metoderna. Inom Southern blot används dock NBT/BCIP vilket är ett carcinogent ämne vilket bör behandlas med försiktighet. Ur kostnadssynpunkt bör dessutom Southern blot vara sämre. Båda metoderna utgår från en förstärkning av den eftersökta genen följt av en elektrofores. Inom Southern blot går metoden ännu längre när gelens material sedan ska överföras till ett speciellt membran som sedan så småningom behöver antikroppar för detektion.  

2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Hur en Southern blot analys fungerar både teoretiskt och praktiskt. Vilka komponenter den utgår ifrån, hur resultatet blir och hur det sedan tolkas.